一文读懂 RNA 合成与体外转录技术

RNA 合成技术是分子生物学与生物制药领域的核心技术，其产物广泛应用于基因编辑、mRNA 疫苗研发、RNA 干扰（RNAi）、体外翻译等前沿场景。随着对 RNA 功能认知的深化（如非编码 RNA 调控机制、RNA 修饰的生物学意义），合成技术已从传统的序列合成向 “高保真、可修饰、规模化” 方向升级。当前主流技术路径分为体外转录（IVT）和化学合成，其中体外转录因适配长链 RNA 合成、修饰灵活性高、产量稳定等优势，成为科研与产业化的shouxuan方案，尤其在治疗性 mRNA 与向导 RNA（gRNA）制备中占据主导地位。

体外转录（IVT）是 mRNA 规模化生产的核心技术。转录是细胞中从 DNA 产生 RNA 分子的过程。IVT 是基于细胞过程的简化形式，在体外实验条件下从 DNA 模板产生 RNA。

图：RNA合成流程（来源于NEB官网）

体外转录以 DNA 为模板，在 RNA 聚合酶催化下利用核苷三磷酸（NTPs）合成 RNA，完整流程包含模板制备→转录反应→修饰加工→纯化质控4个环节，各步骤的技术细节直接决定产物质量。

模板需包含启动子序列（常用 T7、SP6 启动子），其中 T7 启动子因转录活性高、特异性强成为shouxuan。模板设计需满足：启动子下游序列与目标 RNA 序列一致，无多余碱基干扰；模板纯度需达到无 RNase、无 DNA 酶污染，避免降解转录产物或干扰反应。高质量模板可通过高保真 DNA 聚合酶扩增、柱纯化等方式获得，确保转录反应的高效性。

转录反应的核心是酶系与反应体系的优化：

• RNA 聚合酶选择：需选择对修饰核苷酸耐受性强、产物完整性高的聚合酶，如 T7 RNA 聚合酶可高效催化长链 RNA 合成，且支持假尿苷、5 - 甲基胞苷等修饰核苷酸的掺入；

• 反应体系调控：NTPs 浓度、Mg²⁺浓度、反应温度（通常 37℃）与时间需精准匹配，平衡产量与纯度。例如，加入帽类似物时需调整其与 NTPs 的比例，确保共转录加帽效率；

• 防降解措施：反应体系中需加入 RNase 抑制剂（如小鼠 RNase 抑制剂），避免 RNA 产物被核酸酶降解，同时使用无核酸酶水配制试剂，杜绝污染源。

图：T7转录（来源于NEB官网）

天然 RNA 的修饰的是其发挥生物学功能的关键，体外合成 RNA 需模拟这一过程：

• 5´ 加帽：分为共转录加帽（如使用 ARCA 帽类似物、CleanCap® 试剂）和转录后加帽（如痘苗病毒加帽酶），帽结构（Cap-0、Cap-1）可保护 RNA 免受核酸酶降解，促进核糖体结合与翻译启动；

• 3´ 加尾：通过 E. coli Poly (A) 聚合酶添加 poly (A) 尾，延长 RNA 半衰期，增强体内翻译效率；

• 碱基修饰：掺入假尿苷（Ψ）、N1 - 甲基 - 假尿苷（m1Ψ）等修饰核苷酸，降低 RNA 的免疫原性，这是 mRNA 疫苗研发的核心技术之一。

转录产物需去除游离 NTPs、酶蛋白、DNA 模板等杂质，常用纯化方法包括硅胶柱纯化、LiCl 沉淀等。其中，基于二氧化硅膜的离心柱纯化因操作快速、纯度高，成为主流选择，可实现 RNA 片段（≥25 nt）的高效回收，且能通过调整方案纯化小至 15 nt 的 miRNA 等短链 RNA。

质控环节需检测：RNA 纯度（A260/280≥1.8、A260/230≥1.8）、完整性（RIN 值≥7）、修饰效率（如帽结构比例），可通过毛细管电泳、LC-MS 等技术实现精准表征。